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Chinese

Binding Characterization: SPR and BLI

结合表征：SPR与BLI

SPR vs BLI Decision Matrix

SPR与BLI选择决策矩阵

FactorChoose SPRChoose BLI
SensitivitySmall molecules, fragments (<500 Da)Large complexes, antibodies
ThroughputLow-medium (serial)High (96-well parallel)
Sample purityRequired (clogs fluidics)Tolerates crude lysates
Kinetic resolutionHigher (better for fast kinetics)Lower
Mass transportMore sensitive (may distort kon)Less sensitive
MaintenanceHigh (fluidics system)Low (dip-and-read)
Sample consumptionHigher (continuous flow)Lower
Cost per experimentLower chip cost, higher run costHigher tip cost, lower run cost
考量因素选择SPR选择BLI
灵敏度小分子、片段（<500 Da）大型复合物、抗体
通量中低（串行）高（96孔并行）
样品纯度要求高（易堵塞流路）可兼容粗裂解液
动力学分辨率更高（更适合快速动力学）较低
传质效应更敏感（可能扭曲kon）敏感度较低
维护成本高（流路系统）低（浸取式读取）
样品消耗量高（连续流动）低
单次实验成本芯片成本低，运行成本高耗材（Tip）成本高，运行成本低

Key differences

核心差异

SPR (Surface Plasmon Resonance)

SPR（表面等离子体共振）

  • Mechanism: Detects refractive index changes at gold surface
  • Surface: Gold chip with dextran matrix (CM5, CM7, etc.)
  • Flow: Continuous microfluidics
  • Best for: Small molecules, high-affinity, precise kon/koff
  • 原理：检测金表面的折射率变化
  • 表面载体：带有葡聚糖基质的金芯片（CM5、CM7等）
  • 流动方式：连续微流路
  • 最佳适用场景：小分子、高亲和力体系、精准测定kon/koff

BLI (Biolayer Interferometry)

BLI（生物层干涉法）

  • Mechanism: Measures optical interference pattern shift
  • Surface: Fiber optic biosensor tips (SA, Ni-NTA, AHC)
  • Flow: Dip-and-read (no microfluidics)
  • Best for: High-throughput, crude samples, antibody screening
  • 原理：测量光学干涉图谱偏移
  • 表面载体：光纤生物传感器Tip（SA、Ni-NTA、AHC）
  • 流动方式：浸取式读取（无微流路）
  • 最佳适用场景：高通量、粗样品、抗体筛选

Troubleshooting: Why BLI works but SPR doesn't

故障排查：为何BLI有效但SPR无效

CauseMechanismSolution
Hydrophobic CDRsAdsorb to SPR gold/dextran surfaceAdd 0.05% Tween-20, use CM7 chip with longer dextran
AggregationMass transport artifacts in SPR fluidicsFilter sample (0.22μm), reduce ligand density
High instabilityDegrades during continuous flowShorter cycle time, add stabilizers (trehalose 5%)
Charge mismatchNonspecific binding to charged dextranAdjust buffer pH ±1 from pI, add BSA 1mg/mL
Slow dissociationLong regeneration needed (damages ligand)Use BLI (disposable tips)
原因机制解决方案
疏水性CDR吸附到SPR金表面/葡聚糖基质添加0.05% Tween-20，使用带有更长葡聚糖链的CM7芯片
聚集SPR流路中出现传质伪影过滤样品（0.22μm），降低配体密度
稳定性差连续流动过程中降解缩短循环时间，添加稳定剂（5%海藻糖）
电荷不匹配与带电荷的葡聚糖发生非特异性结合调整缓冲液pH至偏离等电点±1，添加1mg/mL BSA
解离缓慢再生所需时间长（损伤配体）改用BLI（一次性Tip）

Why SPR works but BLI doesn't

为何SPR有效但BLI无效

CauseMechanismSolution
Small analyteBLI less sensitive for <10 kDaUse SPR with appropriate chip
Weak affinity (KD >10μM)Fast dissociation in BLI dipIncrease analyte concentration
Low expressionNot enough signalIncrease biosensor loading
原因机制解决方案
分析物分子小BLI对<10 kDa的样品灵敏度低使用SPR搭配合适芯片
亲和力弱（KD >10μM）BLI浸取过程中解离过快提高分析物浓度
表达量低信号不足提高生物传感器负载量

Mass transport considerations

传质效应考量

Mass transport limitation occurs when analyte cannot diffuse to the surface fast enough to maintain equilibrium. This distorts kinetic parameters.
传质限制指分析物无法足够快地扩散至表面以维持平衡的情况，会扭曲动力学参数。

Symptoms

症状

  • Observed kon appears slower than true kon
  • Linear association phase (instead of exponential)
  • kon varies with ligand density
  • Rmax varies with flow rate
  • 测得的kon比真实值慢
  • 线性结合阶段（而非指数型）
  • kon随配体密度变化
  • Rmax随流速变化

When mass transport matters

传质效应需关注的场景

  • High-affinity interactions (kon >10^6 M^-1s^-1)
  • High ligand density (>500 RU)
  • Slow flow rates (<30 μL/min in SPR)
  • Large analytes (slow diffusion)
  • 高亲和力相互作用（kon >10^6 M^-1s^-1）
  • 高配体密度（>500 RU）
  • 低流速（SPR中<30 μL/min）
  • 大分析物（扩散慢）

Mitigation strategies

缓解策略

StrategySPRBLI
Reduce ligand density<200 RU for high-affinity<0.5 nm shift loading
Increase flow rate50-100 μL/minIncrease shake speed (1000 rpm)
Use oriented immobilizationHis-tag captureBiotinylated ligand
Include in fittingMass transport model (kt)Usually less critical
策略SPRBLI
降低配体密度高亲和力体系<200 RU负载量<0.5 nm偏移
提高流速50-100 μL/min提高振荡速度（1000 rpm）
使用定向固定His标签捕获生物素化配体
拟合时纳入模型传质模型（kt）通常无需重点考虑

Nonspecific binding mitigation

非特异性结合抑制

Buffer additives (ranked by effectiveness)

缓冲液添加剂（按有效性排序）

AdditiveConcentrationMechanismBest For
BSA0.5-1 mg/mLBlocks hydrophobic sitesGeneral use
Tween-200.02-0.05%Prevents surface adsorptionHydrophobic analytes
Trehalose1-5%Stabilizes + blocksUnstable proteins
Sucrose5%BLI-specific blockerBLI tips
Carboxymethyl dextran1 mg/mLCompetitive blockingSPR with charged proteins
NaCl150-500 mMReduces ionic interactionsCharged proteins
添加剂浓度作用机制最佳适用场景
BSA0.5-1 mg/mL封闭疏水位点通用场景
Tween-200.02-0.05%防止表面吸附疏水性分析物
海藻糖1-5%稳定样品+封闭位点不稳定蛋白
蔗糖5%BLI专用封闭剂BLI Tip
羧甲基葡聚糖1 mg/mL竞争性封闭带电荷蛋白的SPR实验
NaCl150-500 mM减少离子相互作用带电荷蛋白

pH optimization

pH优化

  • Keep buffer pH at least 1 unit away from analyte pI
  • pI near 7: Use pH 6.0 or 8.0 buffer
  • Acidic proteins (pI <5): Use neutral or basic buffer
  • Basic proteins (pI >9): Use slightly acidic buffer
  • 缓冲液pH与分析物等电点至少相差1个单位
  • 等电点接近7：使用pH 6.0或8.0的缓冲液
  • 酸性蛋白（pI <5）：使用中性或碱性缓冲液
  • 碱性蛋白（pI >9）：使用弱酸性缓冲液

Reference subtraction

参考通道扣除

Always include:
  • Blank reference channel (no ligand)
  • Buffer-only injections
  • Non-specific binding controls
务必包含：
  • 空白参考通道（无配体）
  • 仅缓冲液进样
  • 非特异性结合对照

Regeneration conditions

再生条件

SPR regeneration scouting (try in order)

SPR再生条件筛选（按顺序尝试）

ConditionTargetsCaution
10 mM Glycine pH 2.0-2.5Most protein-proteinMay denature ligand
10 mM Glycine pH 1.5Strong interactionsHarsh, limit exposure
1-2 M NaClIonic interactionsMild, try first
10 mM NaOHVery stable ligandsCan hydrolyze proteins
10 mM Glycine pH 9-10Acid-stable proteinsCan aggregate
10 mM EDTAHis-tag, metal-dependentStrips Ni-NTA
4 M MgCl2Hydrophobic interactionsCheck ligand stability
条件适用对象注意事项
10 mM 甘氨酸 pH 2.0-2.5大多数蛋白-蛋白相互作用可能使配体变性
10 mM 甘氨酸 pH 1.5强相互作用条件苛刻，限制暴露时间
1-2 M NaCl离子相互作用温和，优先尝试
10 mM NaOH稳定性极高的配体可水解蛋白
10 mM 甘氨酸 pH 9-10耐酸性蛋白可能导致聚集
10 mM EDTAHis标签、金属依赖型相互作用会洗脱Ni-NTA
4 M MgCl2疏水性相互作用检查配体稳定性

Regeneration protocol

再生流程

  1. Start with mildest condition (high salt)
  2. Test 30s contact time
  3. Verify complete dissociation (return to baseline)
  4. Verify retained ligand activity (repeat binding)
  5. Use shortest effective contact time
  1. 从最温和的条件（高盐）开始
  2. 测试30s接触时间
  3. 验证完全解离（回到基线）
  4. 验证配体活性保留（重复结合实验）
  5. 使用最短的有效接触时间

BLI tips

BLI Tip注意事项

  • Tips are often disposable (no regeneration needed)
  • For reuse: Same conditions as SPR, but shorter exposure
  • Anti-His tips: 10 mM Glycine pH 1.5, 30s
  • Streptavidin tips: Generally not regenerable
  • Tip通常为一次性使用（无需再生）
  • 如需重复使用：采用与SPR相同的条件，但缩短暴露时间
  • 抗His Tag Tip：10 mM 甘氨酸 pH 1.5，30s
  • 链霉亲和素Tip：通常不可再生

Common artifacts and solutions

常见伪影及解决方案

Biphasic binding

双相结合

Symptoms: Two-rate association or dissociation Causes:
  • Sample heterogeneity (aggregates)
  • Ligand heterogeneity (multiple conformations)
  • Avidity effects (bivalent analyte)
Solutions:
  • Filter/centrifuge sample
  • Use monovalent Fab fragments
  • Reduce ligand density
  • Fit to heterogeneous model
症状：双速率结合或解离 原因：
  • 样品异质性（聚集物）
  • 配体异质性（多种构象）
  • 亲合力效应（双价分析物）
解决方案：
  • 过滤/离心样品
  • 使用单价Fab片段
  • 降低配体密度
  • 采用异质性模型拟合

Negative dissociation

负向解离

Symptoms: Signal increases during dissociation phase Causes:
  • Ligand leaching from surface
  • Analyte aggregation on surface
  • Reference channel drift
Solutions:
  • Use capture antibody instead of direct immobilization
  • Increase buffer stringency
  • Better reference subtraction
症状：解离阶段信号上升 原因：
  • 配体从表面脱落
  • 分析物在表面聚集
  • 参考通道漂移
解决方案：
  • 使用捕获抗体替代直接固定
  • 提高缓冲液严谨性
  • 优化参考通道扣除

Hook effect

钩状效应

Symptoms: Signal decreases at high analyte concentrations Causes:
  • Surface saturation + rebinding suppression
  • Crowding effects
Solutions:
  • Reduce analyte concentration range
  • Reduce ligand density
  • Use smaller analyte fragments
症状：高分析物浓度下信号下降 原因：
  • 表面饱和+重结合抑制
  • 拥挤效应
解决方案：
  • 缩小分析物浓度范围
  • 降低配体密度
  • 使用更小的分析物片段

Kinetic data quality checklist

动力学数据质量检查清单

Before analysis

分析前

  • Reference-subtracted properly
  • Buffer injection shows flat baseline
  • Rmax consistent across concentrations
  • No systematic drift during association
  • Complete regeneration (return to baseline)
  • Duplicate/triplicate injections consistent
  • 已正确扣除参考通道
  • 缓冲液进样显示平坦基线
  • 不同浓度下Rmax一致
  • 结合阶段无系统性漂移
  • 再生完全（回到基线）
  • 重复进样数据一致

Fitting quality

拟合质量

  • Residuals randomly distributed (no systematic deviation)
  • Chi² < 10% of Rmax (or < 1 RU² for low signals)
  • kon and koff errors < 20% of values
  • KD from kinetics matches equilibrium KD (within 3-fold)
  • Fitted Rmax reasonable (close to theoretical)
  • 残差随机分布（无系统性偏差）
  • Chi² < Rmax的10%（低信号场景<1 RU²）
  • kon和koff的误差<其数值的20%
  • 动力学拟合得到的KD与平衡KD一致（3倍以内）
  • 拟合得到的Rmax合理（接近理论值）

Red flags

警示信号

  • kon approaching mass transport limit (>10^7 M^-1s^-1)
  • koff faster than data acquisition (< 0.01 s^-1 requires faster sampling)
  • Rmax >> theoretical maximum (aggregation or avidity)
  • Large difference between kinetic and equilibrium KD
  • kon接近传质极限（>10^7 M^-1s^-1）
  • koff快于数据采集速度（<0.01 s^-1需更快采样）
  • Rmax远高于理论最大值（聚集或亲合力效应）
  • 动力学KD与平衡KD差异大

References

参考文献

Platform comparisons

平台对比

SPR protocols

SPR实验方案

Troubleshooting

故障排查

Regeneration

再生

Mass transport

传质效应