Binding Characterization: SPR and BLI

结合表征：SPR与BLI

SPR vs BLI Decision Matrix

SPR与BLI选择决策矩阵

Factor	Choose SPR	Choose BLI
Sensitivity	Small molecules, fragments (<500 Da)	Large complexes, antibodies
Throughput	Low-medium (serial)	High (96-well parallel)
Sample purity	Required (clogs fluidics)	Tolerates crude lysates
Kinetic resolution	Higher (better for fast kinetics)	Lower
Mass transport	More sensitive (may distort kon)	Less sensitive
Maintenance	High (fluidics system)	Low (dip-and-read)
Sample consumption	Higher (continuous flow)	Lower
Cost per experiment	Lower chip cost, higher run cost	Higher tip cost, lower run cost

考量因素	选择SPR	选择BLI
灵敏度	小分子、片段（<500 Da）	大型复合物、抗体
通量	中低（串行）	高（96孔并行）
样品纯度	要求高（易堵塞流路）	可兼容粗裂解液
动力学分辨率	更高（更适合快速动力学）	较低
传质效应	更敏感（可能扭曲kon）	敏感度较低
维护成本	高（流路系统）	低（浸取式读取）
样品消耗量	高（连续流动）	低
单次实验成本	芯片成本低，运行成本高	耗材（Tip）成本高，运行成本低

Key differences

核心差异

SPR (Surface Plasmon Resonance)

SPR（表面等离子体共振）

Mechanism: Detects refractive index changes at gold surface
Surface: Gold chip with dextran matrix (CM5, CM7, etc.)
Flow: Continuous microfluidics
Best for: Small molecules, high-affinity, precise kon/koff

原理：检测金表面的折射率变化
表面载体：带有葡聚糖基质的金芯片（CM5、CM7等）
流动方式：连续微流路
最佳适用场景：小分子、高亲和力体系、精准测定kon/koff

BLI (Biolayer Interferometry)

BLI（生物层干涉法）

Mechanism: Measures optical interference pattern shift
Surface: Fiber optic biosensor tips (SA, Ni-NTA, AHC)
Flow: Dip-and-read (no microfluidics)
Best for: High-throughput, crude samples, antibody screening

原理：测量光学干涉图谱偏移
表面载体：光纤生物传感器Tip（SA、Ni-NTA、AHC）
流动方式：浸取式读取（无微流路）
最佳适用场景：高通量、粗样品、抗体筛选

Troubleshooting: Why BLI works but SPR doesn't

故障排查：为何BLI有效但SPR无效

Cause	Mechanism	Solution
Hydrophobic CDRs	Adsorb to SPR gold/dextran surface	Add 0.05% Tween-20, use CM7 chip with longer dextran
Aggregation	Mass transport artifacts in SPR fluidics	Filter sample (0.22μm), reduce ligand density
High instability	Degrades during continuous flow	Shorter cycle time, add stabilizers (trehalose 5%)
Charge mismatch	Nonspecific binding to charged dextran	Adjust buffer pH ±1 from pI, add BSA 1mg/mL
Slow dissociation	Long regeneration needed (damages ligand)	Use BLI (disposable tips)

原因	机制	解决方案
疏水性CDR	吸附到SPR金表面/葡聚糖基质	添加0.05% Tween-20，使用带有更长葡聚糖链的CM7芯片
聚集	SPR流路中出现传质伪影	过滤样品（0.22μm），降低配体密度
稳定性差	连续流动过程中降解	缩短循环时间，添加稳定剂（5%海藻糖）
电荷不匹配	与带电荷的葡聚糖发生非特异性结合	调整缓冲液pH至偏离等电点±1，添加1mg/mL BSA
解离缓慢	再生所需时间长（损伤配体）	改用BLI（一次性Tip）

Why SPR works but BLI doesn't

为何SPR有效但BLI无效

Cause	Mechanism	Solution
Small analyte	BLI less sensitive for <10 kDa	Use SPR with appropriate chip
Weak affinity (KD >10μM)	Fast dissociation in BLI dip	Increase analyte concentration
Low expression	Not enough signal	Increase biosensor loading

原因	机制	解决方案
分析物分子小	BLI对<10 kDa的样品灵敏度低	使用SPR搭配合适芯片
亲和力弱（KD >10μM）	BLI浸取过程中解离过快	提高分析物浓度
表达量低	信号不足	提高生物传感器负载量

Mass transport considerations

传质效应考量

Mass transport limitation occurs when analyte cannot diffuse to the surface fast enough to maintain equilibrium. This distorts kinetic parameters.

传质限制指分析物无法足够快地扩散至表面以维持平衡的情况，会扭曲动力学参数。

Symptoms

症状

Observed kon appears slower than true kon
Linear association phase (instead of exponential)
kon varies with ligand density
Rmax varies with flow rate

测得的kon比真实值慢
线性结合阶段（而非指数型）
kon随配体密度变化
Rmax随流速变化

When mass transport matters

传质效应需关注的场景

High-affinity interactions (kon >10^6 M^-1s^-1)
High ligand density (>500 RU)
Slow flow rates (<30 μL/min in SPR)
Large analytes (slow diffusion)

高亲和力相互作用（kon >10^6 M^-1s^-1）
高配体密度（>500 RU）
低流速（SPR中<30 μL/min）
大分析物（扩散慢）

Mitigation strategies

缓解策略

Strategy	SPR	BLI
Reduce ligand density	<200 RU for high-affinity	<0.5 nm shift loading
Increase flow rate	50-100 μL/min	Increase shake speed (1000 rpm)
Use oriented immobilization	His-tag capture	Biotinylated ligand
Include in fitting	Mass transport model (kt)	Usually less critical

策略	SPR	BLI
降低配体密度	高亲和力体系<200 RU	负载量<0.5 nm偏移
提高流速	50-100 μL/min	提高振荡速度（1000 rpm）
使用定向固定	His标签捕获	生物素化配体
拟合时纳入模型	传质模型（kt）	通常无需重点考虑

Nonspecific binding mitigation

非特异性结合抑制

Buffer additives (ranked by effectiveness)

缓冲液添加剂（按有效性排序）

Additive	Concentration	Mechanism	Best For
BSA	0.5-1 mg/mL	Blocks hydrophobic sites	General use
Tween-20	0.02-0.05%	Prevents surface adsorption	Hydrophobic analytes
Trehalose	1-5%	Stabilizes + blocks	Unstable proteins
Sucrose	5%	BLI-specific blocker	BLI tips
Carboxymethyl dextran	1 mg/mL	Competitive blocking	SPR with charged proteins
NaCl	150-500 mM	Reduces ionic interactions	Charged proteins

添加剂	浓度	作用机制	最佳适用场景
BSA	0.5-1 mg/mL	封闭疏水位点	通用场景
Tween-20	0.02-0.05%	防止表面吸附	疏水性分析物
海藻糖	1-5%	稳定样品+封闭位点	不稳定蛋白
蔗糖	5%	BLI专用封闭剂	BLI Tip
羧甲基葡聚糖	1 mg/mL	竞争性封闭	带电荷蛋白的SPR实验
NaCl	150-500 mM	减少离子相互作用	带电荷蛋白

pH optimization

pH优化

Keep buffer pH at least 1 unit away from analyte pI
pI near 7: Use pH 6.0 or 8.0 buffer
Acidic proteins (pI <5): Use neutral or basic buffer
Basic proteins (pI >9): Use slightly acidic buffer

缓冲液pH与分析物等电点至少相差1个单位
等电点接近7：使用pH 6.0或8.0的缓冲液
酸性蛋白（pI <5）：使用中性或碱性缓冲液
碱性蛋白（pI >9）：使用弱酸性缓冲液

Reference subtraction

参考通道扣除

Always include:

Blank reference channel (no ligand)
Buffer-only injections
Non-specific binding controls

务必包含：

空白参考通道（无配体）
仅缓冲液进样
非特异性结合对照

Regeneration conditions

再生条件

SPR regeneration scouting (try in order)

SPR再生条件筛选（按顺序尝试）

Condition	Targets	Caution
10 mM Glycine pH 2.0-2.5	Most protein-protein	May denature ligand
10 mM Glycine pH 1.5	Strong interactions	Harsh, limit exposure
1-2 M NaCl	Ionic interactions	Mild, try first
10 mM NaOH	Very stable ligands	Can hydrolyze proteins
10 mM Glycine pH 9-10	Acid-stable proteins	Can aggregate
10 mM EDTA	His-tag, metal-dependent	Strips Ni-NTA
4 M MgCl2	Hydrophobic interactions	Check ligand stability

条件	适用对象	注意事项
10 mM 甘氨酸 pH 2.0-2.5	大多数蛋白-蛋白相互作用	可能使配体变性
10 mM 甘氨酸 pH 1.5	强相互作用	条件苛刻，限制暴露时间
1-2 M NaCl	离子相互作用	温和，优先尝试
10 mM NaOH	稳定性极高的配体	可水解蛋白
10 mM 甘氨酸 pH 9-10	耐酸性蛋白	可能导致聚集
10 mM EDTA	His标签、金属依赖型相互作用	会洗脱Ni-NTA
4 M MgCl2	疏水性相互作用	检查配体稳定性

Regeneration protocol

再生流程

Start with mildest condition (high salt)
Test 30s contact time
Verify complete dissociation (return to baseline)
Verify retained ligand activity (repeat binding)
Use shortest effective contact time

从最温和的条件（高盐）开始
测试30s接触时间
验证完全解离（回到基线）
验证配体活性保留（重复结合实验）
使用最短的有效接触时间

BLI tips

BLI Tip注意事项

Tips are often disposable (no regeneration needed)
For reuse: Same conditions as SPR, but shorter exposure
Anti-His tips: 10 mM Glycine pH 1.5, 30s
Streptavidin tips: Generally not regenerable

Tip通常为一次性使用（无需再生）
如需重复使用：采用与SPR相同的条件，但缩短暴露时间
抗His Tag Tip：10 mM 甘氨酸 pH 1.5，30s
链霉亲和素Tip：通常不可再生

Common artifacts and solutions

常见伪影及解决方案

Biphasic binding

双相结合

Symptoms: Two-rate association or dissociation Causes:

Sample heterogeneity (aggregates)
Ligand heterogeneity (multiple conformations)
Avidity effects (bivalent analyte)

Solutions:

Filter/centrifuge sample
Use monovalent Fab fragments
Reduce ligand density
Fit to heterogeneous model

症状：双速率结合或解离原因：

样品异质性（聚集物）
配体异质性（多种构象）
亲合力效应（双价分析物）

解决方案：

过滤/离心样品
使用单价Fab片段
降低配体密度
采用异质性模型拟合

Negative dissociation

负向解离

Symptoms: Signal increases during dissociation phase Causes:

Ligand leaching from surface
Analyte aggregation on surface
Reference channel drift

Solutions:

Use capture antibody instead of direct immobilization
Increase buffer stringency
Better reference subtraction

症状：解离阶段信号上升原因：

配体从表面脱落
分析物在表面聚集
参考通道漂移

解决方案：

使用捕获抗体替代直接固定
提高缓冲液严谨性
优化参考通道扣除

Hook effect

钩状效应

Symptoms: Signal decreases at high analyte concentrations Causes:

Surface saturation + rebinding suppression
Crowding effects

Solutions:

Reduce analyte concentration range
Reduce ligand density
Use smaller analyte fragments

症状：高分析物浓度下信号下降原因：

表面饱和+重结合抑制
拥挤效应

解决方案：

缩小分析物浓度范围
降低配体密度
使用更小的分析物片段

Kinetic data quality checklist

动力学数据质量检查清单

Before analysis

分析前

Reference-subtracted properly
Buffer injection shows flat baseline
Rmax consistent across concentrations
No systematic drift during association
Complete regeneration (return to baseline)
Duplicate/triplicate injections consistent

已正确扣除参考通道
缓冲液进样显示平坦基线
不同浓度下Rmax一致
结合阶段无系统性漂移
再生完全（回到基线）
重复进样数据一致

Fitting quality

拟合质量

Residuals randomly distributed (no systematic deviation)
Chi² < 10% of Rmax (or < 1 RU² for low signals)
kon and koff errors < 20% of values
KD from kinetics matches equilibrium KD (within 3-fold)
Fitted Rmax reasonable (close to theoretical)

残差随机分布（无系统性偏差）
Chi² < Rmax的10%（低信号场景<1 RU²）
kon和koff的误差<其数值的20%
动力学拟合得到的KD与平衡KD一致（3倍以内）
拟合得到的Rmax合理（接近理论值）

binding-characterization

Original

Translation

Binding Characterization: SPR and BLI

结合表征：SPR与BLI

SPR vs BLI Decision Matrix

SPR与BLI选择决策矩阵

Key differences

核心差异

SPR (Surface Plasmon Resonance)

SPR（表面等离子体共振）

BLI (Biolayer Interferometry)

BLI（生物层干涉法）

Troubleshooting: Why BLI works but SPR doesn't

故障排查：为何BLI有效但SPR无效

Why SPR works but BLI doesn't

为何SPR有效但BLI无效

Mass transport considerations

传质效应考量

Symptoms

症状

When mass transport matters

传质效应需关注的场景

Mitigation strategies

缓解策略

Nonspecific binding mitigation

非特异性结合抑制

Buffer additives (ranked by effectiveness)

缓冲液添加剂（按有效性排序）

pH optimization

pH优化

Reference subtraction

参考通道扣除

Regeneration conditions

再生条件

SPR regeneration scouting (try in order)

SPR再生条件筛选（按顺序尝试）

Regeneration protocol

再生流程

BLI tips

BLI Tip注意事项

Common artifacts and solutions

常见伪影及解决方案

Biphasic binding

双相结合

Negative dissociation

负向解离

Hook effect

钩状效应

Kinetic data quality checklist

动力学数据质量检查清单

Before analysis

分析前

Fitting quality

拟合质量

Red flags

警示信号

References

参考文献

Platform comparisons

平台对比

SPR protocols

SPR实验方案

Troubleshooting

故障排查

Regeneration

再生

Mass transport

传质效应